高效液相色谱法的原理_高效液相色谱仪的使用和原理分析-天天微动态
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1、高效液相色谱法(HPLC)是目前应用广泛的分离、分析、纯化有机化合物(包括能通过化学反应转变为有机化合物的无机物)的有效方法之一。
2、 在已知的有机化合物中，约有80%能用高效液相色谱法分离、分析，而且由于此法条件温和，不破坏样品，因此特别适合高沸点、难气化挥发、热稳定性差的有机化合物和生命物质。
(资料图)
3、HPLC系统一般由输液泵、进样器、色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成。
4、其中输液泵、色谱柱、检测器是关键部位。
5、有的仪器还有梯度洗脱装置、在线脱气机、自动进样器、与柱或保护住、柱温控制器等，现代HPLC仪还有微机控制系统，进行自动化仪器控制和数据处理。
6、制备型HPLC仪还备有自动馏分收集装置。
7、目前常见的HPLC仪生产厂家国外有Waters 公司、Agilent 公司(原HP公司)、岛津公司等，国内有上海伍丰科学仪器有限公司，上海禾工科学仪器有限公司，大连依利特公司、北京创新通恒、北京温分等。
8、一、输液泵1.泵的构造和性能输液泵是HPLC系统中最重要的部件之一。
9、泵的性能好坏直接影响到整个质量和分析结果的可靠性。
10、输液泵应具备如下性能:①流量稳定，其RSD应小于0.5%，这关系到定性定量的准确性;②流量范围宽，分析型应在0.1~10ml/min范围内连续调，制备型应能达到100ml/min;③输出压力高，一般应能达到150~300KG/CM2:④液缸容积小;⑤密封性能好，耐腐蚀。
11、泵的种类很多，按输液性质可分为恒压泵和恒流泵。
12、恒流泵按结构又可分为螺旋注射泵、柱塞往复泵和隔往复泵。
13、恒压泵受柱阴影响，流量不稳定;螺旋泵缸体太大，这两种泵己被淘汰目前应用最多的是柱塞往复泵。
14、柱塞往复泵的液缸容积小，可至0.1ml，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱;改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱压影响;泵压可达400KG/CM2。
15、ADW主要缺点是输出的脉冲性较大，现多彩采用双泵系统来克服。
16、双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好(RSD为0.1%左右，串联泵为0.2~0.3%)，但出现故障的机会较多(因多了单向阀)，价格也较贵。
17、二、进样器一般HPLC分析常用六通进样阀(以美国RHEODYNE公司的7725和7725I型最常见)，其关键部件由圆形密封垫子(转子)和固定底座(定子)组成。
18、耐高压(35~40MPA)，进样量准确，重复性好(0.5%)，操作方便。
19、六通阀进样方式有部分装液法和完全装液法两种。
20、①用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的50%(最多75%)，并要求每次进样体积准确、相同。
21、此法进样的准确度和重复性决定于注器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。
22、②用完全装液法进样时，进样量应不小于定量环体积的5~10倍9最少3倍，这样才能完全置换定量环内和流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。
23、三、色谱柱色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。
24、对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。
25、市售的用于HPLC的各种微粒填料好多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球(包括离子交换树脂)、多孔碳等，其粒度一般为3，5，7，10UM等，柱效理论值可达5~16万/米。
26、对于一般的分析只需5000塔板数的柱效;对于同系物分析，只要500即可;对于较难的分离物质对则可采用高达2万的柱子，因此一般10~30CM左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。
27、柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，不要有合理的柱结构(尽可能减少填充床以外的死体积)及装填技术。
28、即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。
29、这种管壁区大约是从管壁向内算起30倍料径的厚度。
30、在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。
31、四、检测器HPLC的检测器分为两类:通用型检测器和专用型检测器。
32、1.通用型检测器可连续测量色谱柱的流出物的全部特性变化，通常采用差分测量法，这类检测器包括示差折光检测器、介电常数检测器、电导检测器等，通用检测器适用范围广，但由于对流动相有响应，因此易受温度变化、流动相和组分的变化的影响，噪声和漂移都比较大，灵敏度较低，不能用梯度洗脱。
33、2.专用型检测器用以测量被分离样品组分某种特性的变化。
34、这类检测器对样品中组分的某种物理或化学性质敏感，而这一性质是流动相所不具备的，或至少在操作条件下不显示。
35、这类检测器包括紫外检测器、荧光检测器、放射性检测器等。
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